|
|
Anizotropní techniky ve studiu cytoplazmy
Sýkorová, Kateřina ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Cílem této práce bylo provést srovnávací experimenty pomocí časově rozlišené anizotropie a ustálené anizotropie v bakteriích kmene Cupriavidus necator. Fluorescenční sondou pro skenování buněčného vzorku byl vybrán fluorescein, respektive jeho derivát BCECF_AM. Pomocí ověřovacího experimentu v systému glycerol/voda s přídavkem fluoresceinu, byla ověřena anizotropie a vypočítán molární hydrodynamický objem jedné molekuly fluoresceinu, který přibližně odpovídal jeho reálné hodnotě. Pomocí fluorescenční anizotropní mikroskopie byly získány obrázky bakterií s příslušnými středními hodnotami anizotropií. Skeny bakterií CN H16 a mutantů CN PHB-4, ukázaly patrné rozdíly mezi uniformitou vnitřního prostředí.
|
|
|
Podpora fyzikální interakce hyaluronanu a vybraných hydrofobních solutů
Michalicová, Petra ; Kislinger, Jiří (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
Metodou fluorescenční spektroskopie byl zkoumán vliv způsobu přípravy systému hyaluronan-fluorescenční sonda na vzájemné interakce ve vodném prostředí. Bylo navrženo několik experimentů, pro které byly jako fluorescenční sondy vybrány pyren, prodan, perylen a difenylhexatrien (DPH). První skupina experimentů byla založena na ověření závěrů z práce T. Brownové a byla zaměřena na prostou interakci hyaluronanu a hydrofobní látky. Ve druhé řadě experimentů byl hyaluronan vysoušen za zvýšené teploty a poté k němu byla přidána fluorescenční sonda. Tato metoda měla rozrušit hydratační obal hyaluronanu a zpřístupnit tak hydrofobní části řetězce pro fluorofor. Přestože v první skupině experimentů bylo zahrnuto široké spektrum koncentrací sondy, nepodařilo se prokázat interakce mezi látkami v systému. Stejně tak měření s předsušeným hyaluronanem nenaznačuje, že by v systému docházelo k interakcím.
|
|
|
Fosfolipidy jako základ biodegradabilních nosičových systémů
Burdíková, Jana ; Čeppan, Michal (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřena na zkoumání systému fosfolipid-hyaluronan. Nejdříve byla nalezena vhodná metoda pro přípravu zásobního roztoku fosfolipidu/lipidu a vhodná fluorescenční sonda. Jako metoda přípravy zásobního roztoku byla vybrána sonifikace a jako fluorescenční sonda pyren. Ze skupiny fosfolipidů byl použit lecitin. Pro srovnání byl vedle fosfolipidu použit i lipid fosfátovou skupinu postrádající (DPTAP), popřípadě směs lipidu a fosfolipidu (DPPC a DPTAP). Kromě hyaluronanu byly pro srovnání použity i jiné polyelektrolyty (polystyrensulfonát sodný a alginát sodný). Měření probíhala jak ve vodě, tak v roztoku fosfátového pufru. Veškerá měření proběhla pomocí fluorescenční spektroskopie a dynamického rozptylu světla.
|
|
|
Interakce hyaluronanu s hydrofobními soluty
Slezáková, Dagmar ; Knotková,, Kateřina (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá hydrofobními interakcemi nativního hyalorunanu s vybranými soluty. Na základě literárních rešerší byly vybrány fluorescenční sondy a fluoreskující biologicky aktivní látky, které se využívají právě ke studiu koloidních roztoků biopolymerů, a to 6-(p-toluinido)-2-naftalensulfonová kyselina (polaritní sonda), lipofilní vitamín (±)-alfa-tokoferol, pyren (polaritní sonda) a hydrofilní vitamín riboflavin. V experimentální části byl studován vliv rozpouštědel s různou polaritou, respektive relativní permitivitou, na emisní spektra. Byly studovány interakce nativního hyaluronanu s TNS, dále interakce s vlivem iontové síly, které však nebyly prokázány, což bylo pravděpodobně způsobeno dostatečně silným solvatačním obalem hyaluronanu. Prokázání interakce se podařilo až po procesu lyofilizace a následné rehydratace vzorků. Další studium interakcí bylo prováděno se biologicky aktivní látkou riboflavinem, a to pomocí měření REES efektu v nativním hyaluronanu o různých koncentracích a různých molekulových hmotnostech. Nedocházelo však k posunům emise, a tak se nepodařilo prokázat interakce riboflavinu s HA v rámci zvolených koncentrací. Použitím další biologicky aktivní látky - alfa-tokoferol bylo zkoumáno asociativní chování hyalorunanu a také byla sledována anizotropie fluorescence alfa-tokoferolu v různých koncentracích a molekulových hmotnostech nativního hyaluronanu. Anizotropie fluorescence dosahovala vysokých hodnot v porovnání s referenčním roztokem směsi glycerol-ethanol, která však závisela více na molekulové váze než na koncentraci hyaluronanu. Prokázání interakcí hyaluronanu bylo studováno také pomocí polaritní sondy pyren v různých koncentracích a molekulových hmotnostech hyaluronanu. Poměr 1:3 nevykazoval koncentrační závislost v rámci vybraných koncentrací až na molekulovou hmotnost 253,9 kg mol–1. Jak alfa-tokoferol, tak i pyren byly podrobeny lyofilizaci a následné rehydrataci, což vedlo ke zlepšení interakcí těchto sond s hyaluronanem.
|
|
|
Fluorescence ve výzkumu hydrofilních oblastí asociativních koloidů
Londinová, Monika ; Knotková,, Kateřina (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
Pomocí různých fluorescenčních sond byly zkoumány vlastnosti hyaluronanu, neboť je slibným nosičem aktivních substancí v medicíně a kosmetice. Zvolenými sondami byly: kationaktivní akridinová oranž, Nilská modř A, methylenová modř, amfifilní 4-Di-2-ASP a anionaktivní fluorescein. Kromě fluorescenčních a absorpčních spekter sond byly sledovány elektrostatické a hydrofobní interakce. Sondy v různě polárních prostředích (MeOH, EtOH, DMSO) vykazovaly bathochromní posun emisního maxima a zhášení fluorescenčního záření s rostoucí polaritou roztoků. Ve vodných roztocích chloridů byl zkoumán vliv iontové síly na fluorescenční vlastnosti sondy akridinová oranž a 4-Di-2-ASP. V případě AO se s rostoucí iontovou silou více bránilo tvorbě dimerů AO. CaCl2 nejvíce zvýšil iontovou sílu, nejvíce bránil repulzi karboxylových skupin a tedy expanzi klubka hyaluronanu do roztoku. Naopak emise sondy 4-Di-2-ASP se nejvíce zhášela s přídavkem CaCl2. Při sledování vlivu přídavku hyaluronanu na absorpční a emisní vlastnosti AO způsobily první přídavky (COO– skupin) tvorbu dimerů AO, následovala depolymerizace dimerů a nárůst intenzity emise. Repolymerizace způsobila pokles a poté došlo k opětovnému nárůstu. V případě 4-Di-2-ASP se charakter fluorescence (intenzita emise, poloha maxima) zpočátku neměnil, ale od koncentrace 1 g dm–3 došlo k nárůstu intenzity emise. Sondy methylenová modř a fluorescein byly použity pro spektroskopické studium interakce mezi methylenová modř-fluoresceinovým komplexem a aniontovým a kationtovým tenzidem. Absorbance samotné methylenové modři a fluoresceinu se měnily jen s přídavkem tendzidů s opačným nábojem. Absorbance směsi MB-F se měnila s přídavkem tenzidu CTAC, přídavek SDS do směsi způsobil jen změnu absorpčního spektra MB.
|
|
|
Fluorescenční spektroskopie ve výzkumu aminojílů
Jančík Procházková, Anna ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Aminojíl spadá do velké skupiny organicky modifikovaných jílových materiálů, které mohou v praxi najít řadu uplatnění, zejm. v podobě matrice, která má schopnost organizace a stabilizace inkorporovaných látek. Velmi nadějné je využití aminojílu v medicínských aplikacích, kde je však zapotřebí mít možnost vizualizace daného systému a dějů. Předložená práce se zabývá problematikou vizualizace aminojílu využitím technik fluorescenční spektroskopie. Bylo zjištěno, že aminojíl vykazuje autofluorescenci, která je charakterizována pomocí fluorescenční spektroskopie. Autofluorescence aminojílu však v praxi není využitelná kvůli její slabé intenzitě. Z tohoto důvodu byly zkoumány možnosti modifikace vnitřní struktury implementací europitých iontů, které jsou ve vhodně chelatované podobě schopny fluorescence. A modifikace vnější struktury pomocí elektrostatických interakcí s fluorescenčními sondami. Připravené komplexy byly spektrálně charakterizovány pomocí spektrofluorimetrie a fluorescenční mikroskopie za účelem zhodnocení využitelnosti v praxi.
|
|
|
Studium interakcí hyaluronan-fosfolipid za přítomnosti biokompatibilních neionogenních tenzidů
Burdíková, Jana ; Klučáková, Martina (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato práce je založena na zkoumání agregačního chování cukerných tenzidů a sn-glycero-dipalmitoylphosphatidylcholinu (DPPC) ve vodném prostředí a na studiu interakcí v systémech neionogenní tenzid-DPPC a neionogenní tenzid-DPPC-hyaluronan. Z neionogenních tenzidů byly použity cukerné tenzidy. Chování jednotlivých systémů bylo zkoumáno pomocí fluorescenční spektroskopie. Byly zjištěny hodnoty kritických micelárních koncentrací (CMC) použitých cukerných tenzidů, počátek agregace DPPC, vliv DPPC na agregaci cukerných tenzidů a vliv hyaluronanu na systém neionogenní tenzid-DPPC. Dále byla určena CMC CPC (cetylpyrimidium chlorid), jenž byl použit na zhášení fluorescence při určení agregačních čísel cukerných tenzidů. Při měření byly použity fluorescenční sondy pyren, perylen, nilská červeň, akridinová oranž a hydrofobní barvivo sudánova červeň.
|
|
|
Molecules in Cell Membranes
Timr, Štěpán ; Jungwirth, Pavel (vedoucí práce) ; Böckman, Rainer (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
Biologické membrány se aktivně účastní řady procesů v živých buňkách, a detailní popis jejich struktury, dynamiky a funkce je tudíž nezbytný pro porozumění živým organismům na molekulární úrovni. V této práci jsme využili vysoké časové a prostorové rozlišení poskytované počítačovými simulacemi pro výzkum chování několika druhů molekul, které se mohou vázat do membrán buněk. Kombinace klasických simulací molekulové dynamiky a ab initio výpočtů elektronové struktury nám dovolila charakterizovat optické vlastnosti fluorescenčních sond zanořených v membránách, a tím přispět k rozvoji dvoufotonové polarizační mikroskopie jako nástroje strukturní biologie. Simulace molekulové dynamiky nám dále umožnily popsat na atomární úrovni vratnou vazbu rekoverinu k membráně a rovněž poskytly významný vhled do mechanismu vápníkem indukovaného myristoylového přepínače tohoto proteinu, důležitého pro adaptaci zrakových buněk. Kromě toho jsme zkoumali biologickou úlohu oxidace cholesterolu a porovnali dvě metody popisu membránového napětí v simulacích molekulové dynamiky.
|
|
|
Srovnání vybraných karbocyaninových fluorescenčních sond z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Mudroňová, Kateřina ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál je jednou z nejdůležitějších charakteristik živé buňky. Jednou z možností monitorování jeho změn je použití karbocyaninových fluorescenčních sond. V rámci této práce byly metodou synchronně skenované fluorescence prozkoumány vlastnosti několika sond. Z nich byly vybrány tři vhodné látky pro další experimenty jako doplněk k sondám diSC3(3) a diSC3(5), které představují standardní sondy používané v oddělení biofyziky FÚUK. Konkrétně se jedná o sondy diOC3(3), diIC1(3) a diIC2(5). Byla porovnána rychlost jejich akumulace v buňkách S. cerevisiae, na základě které jsme zjišťovali, zda jsou substráty MDR pump. Dále se tato práce zabývá otázkou ekvivalence výsledků obdržených pomocí různých fluoroforů a jejich vzájemného ovlivňování. Pro tyto účely byla zvolena dvojice sond diSC3(3) a diSC3(5), pomocí nichž byl zkoumán vliv acidifikace na membránový potenciál kvasinek S. cerevisiae. Bylo zjištěno, že informace o depolarizaci získané pomocí odlišných sond, se dobře shodují.
|
|
|
Srovnání fluorescenčních sond disC3(3) a diSC3(5) z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Matunová, Petra ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál představující napětí na membráně je důležitý parametr pro studium buněčných procesů. Pomocí karbocyaninových sond diS-C3(3) a diS-C3(5), označovaných společným názvem 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide, lze monitorovat změny membránového potenciálu buněk, které jsou příliš malé pro zavedení mikroelektrod. Tyto změny lze sledovat v jednotkách mV. Spektrální analýza buněčných suspenzí kvasinek S. cerevisiae s fluorescenčními sondami umožňuje stanovit koncentrace extracelulárního a intracelulárního fluorescenčního barviva, z jejichž znalosti lze určit hodnoty změn membránového potenciálu, které je možné vyvolat vnějšími podněty. Součástí práce je porovnání akumulace obou fluorescenčních sond a také experimenty zacílené na sledování vlivu vybraných látek a jejich měnících se koncentrací na volnou a vázanou složku barviva.
|
host ::
RSS.